Молекулы соединяются … по щелчку!
Откуда берутся лекарственные средства? С древних времен человечество пользовалось экстрактами растений в лекарственных целях. Проблема с таким подходом в том, что его сложно масштабировать: чтобы собрать даже одну дозу активного средства может потребоваться обработка нескольких растений. Настоящая революция в фармацевтике произошла только после того, как ученые научились синтезировать природные лекарственные молекулы в лаборатории поскольку это позволило масштабировать производство лекарственных средств. Однако, природные лекарственные средства как правило имеют сложную структуру, которую сложно воссоздать в ходе синтеза в лаборатории (природа гораздо лучше нас справляется с задачей органического синтеза). Поэтому всегда был актуален поиск более простых способов синтеза лекарственных средств, что на практике сводится к поиску более простых способов соединения маленьких фрагментов и образования функциональных групп.
К 2000 году, Барри Шарплесс предложил называть быстрые химические реакции с использованием простых реагентов протекающих без образования нежелательных побочных продуктов “химией щелчка”. Вы можете задаться вопросом: а почему такое, казалось бы, крайне обобщенное описание заслуживает отдельного термина? Дело в том, что при синтезе подавляющего большинства соединений вам приходится иметь дело с множеством стадий, каждая из которых может быть очень капризной. Некоторые реакции нужно проводить при очень низких температурах, например: -79°C (такие температуры достигаются охлаждением ацетона с помощью сухого льда), а некоторые при очень высоких: 150-200°C (достигаются с помощью нагревания песчаной или масляной бани). Для некоторых реакций нужны труднодоступные катализаторы или специфичные растворители (многие из которых токсичны для живых организмов). Так что тот набор реакций, которые не требуют экстремальных условий, и которые можно было бы проводить в водных растворах, вполне заслуживает отдельного имени.
В качестве первого примера новой химии щелчка, Шарплесс с коллегами предложили использовать на тот момент хорошо изученное 1,3-диполярное циклоприсоединение, впервые проведенное в 1893 году Артуром Михаэлем. В ходе этой реакции, молекула с азидной группой (три атома азота, соединенные друг с другом) реагирует с алкином (вещество с тройной связью углерод - углерод). Присоединение одной молекулы к другой дает триазол-циклическое гетероциклическое кольцо с тремя азидными атомами азота и двумя атомами углерода.В результате реакции получается смесь изомеров триазола (продуктов с одинаковым качественным составом, но разной структурой). После Михаэля эту же реакцию подробнее исследовал Рольф Хьюсген в середине XX века. Он предложил вариант реакции проводящейся под действием лишь температуры в результате которой также выделилась смесь продуктов.
Движущая сила реакции:
Почему реакция вообще протекает? Она возможна из-за довольно высокой реакционной способности азидов во взаимодействии с алкинами. В 1930-х годах, Лоуренс Брокуэй и Лайнус Полинг отметили дипольную (имеющую положительный и отрицательный заряд) природу азидов описав их резонансные структуры:
Хьюисген предположил, что азиды, содержат диполи на 1-ом и 3-ем атомах (как и показано на рис. 2). Это свойство азидов облегчает движение электронов в реакции, так как у нас есть уже явно-выраженный нуклеофил на 3 атоме (который может атаковывать двойную/тройную связь) и электрофил на 1 атоме (который принимает электроны с этой двойной/тройной связи). Наличие диполей на азидной группе тем самым увеличивает вероятность вступления в 1,3-циклоприсоединение образуя 2 прочные С-N связи и соответствующий пятичленный цикл (триазол) (рис. 1).
Помимо азидов, Хьюисген также идентифицировал ряд других 1,3-диполярных соединений, таких как нитрилоксиды, диазоалканы, азометинилиды, нитроны и озон, которые также образуют множество резонансных структур и могут вступать в реакции циклоприсоединения:
Наличие диполей на каждой из структур выше представленных реагентов позволяет им,так же как и азидам, вступать в реакцию и образовывать стабильные пятичленные циклы. Работа Хьюисгена и других, таким образом, заложила основу для 1,3-дипольных циклоприсоединений, что побудило Шарплесса идентифицировать эти реакции как кандидатов для концепции щелчковой химии. Однако, долгое время азиды не использовались в реакциях циклоприсоединения поскольку их реакция с алкинами приводила к образованию практически равномерной смеси 1,4 и 1,5-дизамещенных триазолов (Рис 1.)
Интерес к химии азидов возобновился когда в 2002 году группа Барри Шарплесса опубликовала статью о катализе реакции циклоприсоединения с помощью ионов одновалентной меди. Мало того, что реакция протекала значительно быстрее, так еще и образовывался преимущественно 1,4-продукт.
Огромный успех реакции CuAAC (Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition) в лабораторных условиях быстро вызвал интерес к использованию этого преобразования в биологических системах. Однако, одновалентная медь крайне токсична для живых организмов, т.е. от катализатора нужно отказаться. Но без меди реакция протекает слишком медленно. Чтобы решить эту проблему, нужно вернуться к тому от чего зависит скорость химической реакции:
- Механизм реакции
- Концентрация веществ
- Кинетический контроль (изменение амплитуды энергии активации с помощью катализа)
- Термодинамический контроль (стабильность продуктов и реагентов относительно друг друга)
Дедуктивным методом мы исключаем первые три пункта, так как а) механизм реакции поменять сложно б) увеличивать концентрацию веществ-затратно и тем самым не выгодно в) энергию активации мы меняли когда применяли медный катализ. Тем самым,одним из возможных новых решений для ученых осталось провести “манипуляцию” над реакцией с точки зрения термодинамического контроля: вместо того,чтобы делать переходное состояние более стабильным,мы будем делать реагент менее стабильным.
Таким образом химики пришли к более реакционно-способным (и менее стабильным) реагентам для щелчковых реакций – циклическим алкинам. Одной из причин высокой реакционной способности была напряженная природа в кольце таких диполярофилов, что приводит к высвобождению кольцевой деформации при циклоприсоединении и облегчению протекания реакции. Новый тип циклоприсоединений с использованием данных реагентов теперь называется strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC, стимулируемое напряжением азид-алкинное присоединение).
Начало биоортогональной химии
Химическая биология занимается поиском и разработкой инструментов для изучения биологических систем. Бертоцци изучала мембраны клеток и искала способ научиться “приклеивать” флуоресцентные маркеры к определенным белкам, чтобы следить за их передвижением по клетке. С одной стороны можно с помощью генной инженерии модифицировать белок так, чтобы он уже содержал флуоресцентную часть. Но тогда нам нужно будет присоединять аж целый флуоресцентный белок (например GFP). Было бы неплохо, если бы мы могли соединять маленькую флуоресцентную молекулу с белком словно по щелчку, при этом не нарушая внутриклеточную биохимию системы. Такие реакции называются “биоортогональными” (перпендикулярными базису клеточных реакций). Разработанная в той же группе реакция циклоприсоединения с участием циклооктинов стала одним из первых примеров биоортогональной химии.
Как мы знаем, границей клетки выступает плазматическая мембрана, которая по большей степени состоит из фосфолипидов, однако есть и другие компоненты, встроенные в мембрану. Например, гликаны - комплексы белков с углеводами. Одни из таких углеводов - сиаловые кислоты. Бертоцци заметила, что естественный биосинтез можно модифицировать так, чтобы желаемые (содержащие нужные функциональные группы) молекулы “приспосабливались” к нежеланным субстратам-гликанам, и таким образом встраивались в структуры на мембранах клетки.
Бертоцци научилась кормить клетки модифицированными углеводами (например, сиаловыми кислот с прикрепленной радикальной группой, чаще всего содержащей азидный конец) и вводить в те самые нежеланные субстраты-гликаны. Совершенная “встройка” функциональных групп позволяет в дальнейшем с легкостью “сщелкивать” молекулы с флуоресцентной меткой, у которой может быть циклооктиновый заместитель, который будет вступать в реакцию SPAAC с азидным концом сиаловой кислоты. Флуоресцентная молекула затем позволяла отследить гликаны на поверхности клетки.
Реакция Штаундигера
Другой важной реакций, давшей толчок развитию биоортогональной химии стало использование реакции Штаудингера.
В классической реакции Штаудингера, описанной еще в 1919 году, происходит взаимодействие между фосфином (PR3) и азидом с образованием иминофосфорана, который может либо подвергаться гидролизу (с образованием амина), либо может реагировать с сложными эфирами с образованием амидов.
Главная проблема классической реакции Штаудингера в том, что образующийся иминофосфоран крайне реактивен, а поэтому он не будет дожидаться пока натктнется в растворе на нужный нам сложный эфир и вместо этого будет реагировать с первыми попавшимися молекулами, тем самым понижая выход и селективность реакции. Интерес к реакции Штаудингера возродился когда группа Бертоцци опубликовала статью в котором фосфиновая группа находилась в той же молекуле, что и сложноэфирная группа, тем самым реакция превращалась из межмолекулярной во внутримолекулярную. Внутримолекулярные реакции протекают значительно быстрее просто потому, что две реагирующие части уже находятся в нужной ориентации и им не нужно искать друг друга.
Но оставалась еще одна проблема - после реакции внутри молекулы оставалась группировка оксида фосфина, которая может реагировать с другими молекулами внутри клетки и проявлять цитотоксичные свойства. Проблема была решена группой Рональда Рейнса, которые описали механизм бесследного лигирования, в ходе которого оксид фосфина отщеплялся отдельной молекулой, от которой можно было избавиться на стадии очистки.
Итоги: и к чему все это привело мир?
Реакции, которые можно отнести к химии щелчка, стали незаменимым инструментом химии для синтеза новых макромолекулярных конструкций и изучения биологических систем, и за это Кэролин Бертоцци, Мортен Мелдал и Барри Шарплесс были удостоены Нобелевской премии по химии в 2022 году. Приглашаем читателя ознакомиться с информационной справкой, подготовленной Шведской академией наук для получения дополнительного экскурса в применения химии щелчка.
Пожалуй одним из самых поражающих применений стало использование реакции циклоприсоединения для присоединения флуоросцентных молекул к поверхности клеток, что позволило наблюдать за движением углеводов на поверхности живых клеток внутри живого организма! Углеводы на поверхности клеточной мембраны играют важнейшую роль в передаче сигналов от одной клетке к другой и поэтому занимают центральную роль в биологии организма (передача неправильного сигнала может привести к восприятию клетки как чужеродной и последующему уничтожению в рамках имунного ответа). Способность наблюдать за закономерностями расположения и движения определенных углеводов на живых клетках внутри живых организмов позволяет нам лучше изучить механизмы клеточного общения. Если вас интересуют такие применения, можете почитать эту статью в журнале Bioconjugate Chemistry.